IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) β-galactosidase substratuaren analogoa da, oso induzigarria dena.IPTG-ren indukziopean, induzitzaileak konplexu bat sor dezake proteina errepresiboarekin, proteina errepresiboaren konformazioa aldatu dadin, xede-genearekin konbinatu ezin dadin eta xede-genea modu eraginkorrean adierazten da.Beraz, nola zehaztu behar da IPTGren kontzentrazioa esperimentuan zehar?Zenbat eta handiagoa orduan eta hobe?
Lehenik eta behin, uler dezagun IPTG-ren indukzio-printzipioa: E. coliren laktosa-operoiak (elementuak) hiru egitura-gene ditu, Z,Y eta A, β-galaktosidasa, permeasa eta azetiltransferasa kodetzen dituztenak, hurrenez hurren.lacZ-k laktosa glukosa eta galaktosa bihurtzen du, edo alolaktosan;lacY-k inguruneko laktosa zelula-mintzatik igaro eta zelulan sartzen uzten du;lacA-k azetil-taldea azetil-CoAtik β-galaktosidera transferitzen du, eta horrek efektu toxikoa kentzea dakar.Horrez gain, O sekuentzia eragile bat, hasierako P sekuentzia bat eta I gene erregulatzaile bat daude. I gene-kodea eragile-sekuentziaren O posiziora lotu daitekeen proteina errepresiboa da, operoia (meta) erreprimitua izan dadin eta itzalita.Gene katabolikoaren aktibatzaile proteina-CAP lotura-gune bat ere badago P sekuentzia abiaraztetik gora. P sekuentzia, O sekuentzia eta CAP lotura-guneak batera osatzen dute lac operonaren eskualde erregulatzailea.Hiru entzimen kode-geneak erregulazio-eskualde berberak erregulatzen ditu, gene-produktuen adierazpen koordinatua lortzeko.
Laktosarik ezean, lac operoia (meta) errepresio egoeran dago.Une honetan, PI sekuentzia sustatzailearen kontrolpean adierazitako I sekuentziaren lac errepresiorea O sekuentziarekin lotzen da, eta horrek RNA polimerasa P sekuentziarekin lotzea eragozten du eta transkripzioaren hastapena galarazten du;laktosa dagoenean, lac operoia (meta) induzitu daiteke Operoi (meta) sistema honetan, benetako induzitzailea ez da laktosa bera.Laktosa zelulan sartzen da eta β-galaktosidasak katalizatzen du alolaktosa bihurtzeko.Azken hau, molekula induzitzaile gisa, proteina errepresiboarekin lotzen da eta proteinaren konformazioa aldatzen du, eta horrek proteina errepresiorea O sekuentziatik eta transkripziotik disoziatzea dakar.Isopropylthiogalactoside (IPTG) alolaktosaren eragin bera du.Oso induzitzaile indartsua da, bakterioek metabolizatzen ez dutena eta oso egonkorra dena, beraz, asko erabiltzen da laborategietan.
Nola zehaztu IPTGren kontzentrazio optimoa?Hartu E. coli adibide gisa.
PGEX (CGRP/msCT) errekonbinatzaile positiboa duen E. coli BL21 genetikoki diseinatutako anduia 50μg·mL-1 Amp dituen LB likido-erdi batean inokulatu zen eta gauean hazi zen 37 °C-tan.Goiko kultura 50 μg·mL-1 Amp duten 50 ml-ko LB euskarri likido freskoko 10 botiletan inokulatu zen hedapen-kulturarako 1:100 proportzioan, eta OD600 balioa 0,6 ~ 0,8 zenean, IPTG azken kontzentrazioari gehitu zitzaion.0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 da.Tenperatura berean eta aldi berean induzitu ondoren, bakterio-disoluzioaren 1 mL atera zen bertatik, eta bakterio-zelulak zentrifugazio bidez bildu eta SDS-PAGEra eraman zituzten IPTG-ko kontzentrazio ezberdinek proteinen adierazpenean duten eragina aztertzeko, eta ondoren. hauta ezazu proteina-adierazpen handiena duen IPTG kontzentrazioa.
Esperimentuen ondoren, IPTGren kontzentrazioa ahalik eta handiena ez dela ikusiko da.Hau da IPTGk bakterioekiko nolabaiteko toxikotasuna duelako.Kontzentrazioa gainditzeak zelula ere hilko du;eta, oro har, zelulan zenbat eta proteina disolbagarriagoa adierazi, orduan eta hobea izatea espero dugu, baina kasu askotan IPTGren kontzentrazioa altuegia denean, inklusio kopuru handia sortuko da.Gorputza, baina proteina disolbagarrien kantitatea gutxitu egin zen.Hori dela eta, IPTG kontzentraziorik egokiena askotan ez da zenbat eta handiagoa orduan eta hobe, zenbat eta kontzentrazio txikiagoa baizik.
Ingeniaritza genetikoko anduien indukzio eta hazkuntzaren helburua xede-proteinaren errendimendua handitzea eta kostuak murriztea da.Xede-genearen adierazpenean ez dute soilik tentsioaren faktoreek eta adierazpen-plasmidoek eragiten, baita kanpoko beste baldintza batzuek ere, hala nola induzitzailearen kontzentrazioa, indukzio-tenperatura eta indukzio-denbora.Hori dela eta, oro har, proteina ezezagun bat adierazi eta araztu aurretik, hobe da indukzio denbora, tenperatura eta IPTG kontzentrazioa aztertzea, baldintza egokiak aukeratzeko eta emaitza esperimental onenak lortzeko.
Argitalpenaren ordua: 2021-12-31