IPTG (isopropil-β-D-tiogalaktosidoa) β-galaktosidasa substratuaren analogo bat da, oso induzigarria dena. IPTGren indukzioaren pean, induktoreak konplexu bat osa dezake errepresore proteinarekin, horrela errepresore proteinaren konformazioa aldatzen da, helburu genearekin konbinatu ezin dadin, eta helburu genea eraginkortasunez adierazten da. Beraz, nola zehaztu behar da IPTGren kontzentrazioa esperimentuan zehar? Zenbat eta handiagoa, orduan eta hobeto?
Lehenik eta behin, uler dezagun IPTG indukzioaren printzipioa: E. coli-ren laktosa operonak (elementuak) hiru egitura-gene ditu, Z, Y eta A, β-galaktosidasa, permeasa eta azetiltransferasa kodetzen dituztenak, hurrenez hurren. lacZ-k laktosa hidrolizatzen du glukosa eta galaktosa bihurtzen du, edo alo-laktosa bihurtzen du; lacY-k inguruneko laktosa zelula-mintza zeharkatu eta zelulara sartzen uzten du; lacA-k azetil taldea azetil-CoA-tik β-galaktosidora transferitzen du, eta horrek efektu toxikoa kentzen du. Horrez gain, O sekuentzia eragile bat, P hasierako sekuentzia bat eta I gene erregulatzaile bat daude. I genearen kodea operadore-sekuentziaren O posiziora lotu daitekeen proteina errepresore bat da, operona (meta) erreprimitu eta itzaltzeko. Hasierako P sekuentziaren aurretik, gene katabolikoen aktibatzaile-proteinarako lotura-gune bat ere badago -CAP lotura-gunea. P sekuentziak, O sekuentziak eta CAP lotura-guneak elkarrekin osatzen dute lac operonaren eskualde erregulatzailea. Hiru entzimen kodetzaile geneak eskualde erregulatzaile berak erregulatzen ditu gene produktuen adierazpen koordinatua lortzeko.
Laktosarik ezean, lac operoia (meta) errepresio egoeran dago. Une horretan, PI sustatzaile sekuentziaren kontrolpean I sekuentziak adierazten duen lac errepresorea O sekuentziara lotzen da, eta horrek RNA polimerasa P sekuentziara lotzea eragozten du eta transkripzioaren hasiera inhibitzen du; laktosa dagoenean, lac operoia (meta) induzi daiteke. Operon (meta) sistema honetan, benetako induzitzailea ez da laktosa bera. Laktosa zelulara sartzen da eta β-galaktosidasak katalizatzen du alolaktosa bihurtzeko. Azken hau, induzitzaile molekula gisa, errepresore proteinari lotzen zaio eta proteinaren konformazioa aldatzen du, eta horrek errepresore proteina O sekuentziatik bereiztea eta transkripzioa dakar. Isopropiltiogalaktosidoak (IPTG) alolaktosaren efektu bera du. Induzitzaile oso indartsua da, bakterioek ez dute metabolizatzen eta oso egonkorra da, beraz, laborategietan asko erabiltzen da.
Nola zehaztu IPTG-ren kontzentrazio optimoa? Hartu E. coli adibide gisa.
pGEX birkonbinatzaile positiboa (CGRP/msCT) duen genetikoki eraldatutako E. coli BL21 anduia 50μg·mL-1 Amp-eko LB likido medio batean txertatu zen, eta gau osoan zehar 37°C-tan landu zen. Goiko kultura 50mL-ko LB likido medio freskoko 10 botilatan txertatu zen, 50μg·mL-1 Amp-ekoa, 1:100 proportzioan hedapen-kulturarako, eta OD600 balioa 0,6~0,8 zenean, IPTG gehitu zitzaion azken kontzentrazioari. 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0mmol·L-1 da. Tenperatura eta denbora berean indukzioa egin ondoren, bakterio-disoluziotik 1 mL hartu zen bertatik, eta bakterio-zelulak zentrifugazio bidez bildu eta SDS-PAGE bidez aztertu ziren IPTG kontzentrazio desberdinek proteinen adierazpenean duten eragina aztertzeko, eta ondoren proteina-adierazpen handiena zuen IPTG kontzentrazioa hautatzeko.
Esperimentuen ondoren, ikusiko da IPTG-ren kontzentrazioa ez dela ahalik eta handiena. Hau da, IPTG-k bakterioentzat toxikotasun jakin bat duelako. Kontzentrazioa gainditzeak zelula ere hilko du; eta, oro har, espero dugu zelulan proteina disolbagarri gehiago adierazita, orduan eta hobeto, baina kasu askotan IPTG-ren kontzentrazioa altuegia denean, inklusio kopuru handia sortuko da. Gorputzean, baina proteina disolbagarri kopurua gutxitzen da. Beraz, IPTG kontzentrazio egokiena ez da askotan zenbat eta handiagoa orduan eta hobeto, baizik eta zenbat eta txikiagoa.
Genetikoki eraldatutako anduien indukzio eta laborantzaren helburua proteina-errendimendua handitzea eta kostuak murriztea da. Gene-xedearen adierazpena ez dute anduiaren beraren faktoreek eta adierazpen-plasmidoak bakarrik eragiten, baita kanpoko beste baldintza batzuek ere, hala nola induzitzailearen kontzentrazioak, indukzio-tenperaturak eta indukzio-denborak. Beraz, oro har, proteina ezezagun bat adierazi eta purifikatu aurretik, hobe da indukzio-denbora, tenperatura eta IPTG kontzentrazioa aztertzea, baldintza egokiak hautatzeko eta emaitza esperimental onenak lortzeko.
Argitaratze data: 2021eko abenduaren 31a